Sequenzierung und Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase aus Tenebrio molitor (Mehlwurm)
Daniel Knobeloch
thg 9 2002 · GRIN Verlag
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Diplomarbeit aus dem Jahr 2002 im Fachbereich Biologie - Genetik / Gentechnologie, Note: 1,7, , Sprache: Deutsch, Abstract: Die Sequenzierung und Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase (TIM) aus Insekten wurde nach einer Internet-Datenbankrecherche der geeignete Organismus Tenebrio molitor aus der Klasse der Käfer ausgewählt. Aus dessen Larve, die eine ausreichende Menge an Total-RNA aufweist, um die erfolgreiche Transkription in cDNA zu erlauben, konnte ein Teil im Geninneren befindlicher Sequenz amplifiziert und sequenziert werden. Bei der anschließenden Sequenzierung der genomischen DNA mittels spezifischer Primer, deren Sequenz-Abfolge aus der mRNA abgeleitet wurde, konnte die Position eines Introns lokalisiert und deren Basenabfolge bestimmt werden. Der Intronpositionsvergleich mit den zurzeit in Insekten bekannten Introns erbrachte eine neue Position, die nur in einer anderen noch nicht veroffentlichen TIM-Sequenz aus einem Kafer zu finden ist. Fur die Sequenzierung des 5 ́- und des 3 ́-Endes wurde das RACE-PCR-System (rapid amplification of either 5 ́ or 3 ́ cDNA ends-Polymerase-Kettenreaktion) verwendet. Dadurch konnte das noch fehlende 5 ́-Ende erfolgreich sequenziert werden. Nach Vergleich mit vollständig bekannten TIM-Sequenzen aus anderen Arten konnte das noch fehlende 3 ́ Ende auf eine Lange von 36 Basen bestimmt werden. Nach Vervollständigung der TIM-Sequenz durch Sequenzvergleiche mit bekannten TIM-Sequenzen aus Insekten und der anschließenden Herstellung eines Genkonstruktes fur ein Fusionsprotein, das sowohl den Nachweis als auch die Reinigung des Proteins erlaubt, konnte ein Expressionssystem verwendet werden, mit dem zurzeit die größtmögliche Menge an nativem Protein exprimiert werden kann. Dieses Fusionsprotein konnte über eine Affinitätschromatographie mittels myc-Tag gereinigt werden. Bei der gereinigten Proteinfraktion konnte eine Enzymaktivität mittels eines gekoppelten Aktivitätstestes nachgewiesen werden.
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